自新冠肺炎疫情發(fā)生以來，全世界都在關注新冠肺炎的相關知識，尤其是防治措施，科研人員與醫(yī)護人員全力研究新型冠狀病毒（COVID-19，以下簡稱新冠病毒）的檢測診斷及其防治措施。COVID-19是一種RNA病毒，其RNA有自我復制和逆轉錄兩種復制方式。病毒在復制過程中容易發(fā)生變異，這是RNA病毒的一個共性，如原本為低致病性禽流感病毒株（H5N2、H7N7、H9N2），可經(jīng)6~9個月禽間流行迅速變異而成為高致病性毒株（H5N1），這給有效疫苗的研制增加了困難。為了減少病毒的散播，更好地控制傳染源，需盡早確診感染者，病原學檢測成為患者確診的主要依據(jù)之一，而病毒核酸檢測是病原學檢查的快速診斷方法。
臨床常用的核酸檢測技術主要有常規(guī)PCR、套式PCR、實時熒光PCR和等溫擴增技術等。新冠病毒是通過特定細胞表面的受體入侵細胞造成感染，并利用宿主細胞進行復制增殖，引起宿主發(fā)病。病毒核酸檢測的原理，即根據(jù)病毒堿基尋找區(qū)別于其他病毒的核酸序列，由此設計引物或探針，實現(xiàn)核酸序列的“靶向匹配”；再通過細胞裂解液，提取病毒核酸，實時熒光RT-PCR擴增40次循環(huán)以上，使其核酸數(shù)量可達到足夠通過熒光等常規(guī)方法進行檢測。其中最關鍵的就是引物和探針的設計，使之與該病毒核酸特定區(qū)域高度匹配，即特異性很強，一旦待檢標本PCR擴增結果為陽性，則證明該標本中存在該病毒核酸。我國頒布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》中明確指出，鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸為陽性，可作為新冠病毒肺炎的病原學診斷之一，而且下呼吸道標本（痰或氣道抽取物）更加準確。但在疫病發(fā)生初期有人報道稱，新冠肺炎患者中核酸檢測的陽性率約為30-50%；而鐘南山院士發(fā)布的近1100例新冠肺炎患者臨床數(shù)據(jù)CT檢查顯示，76.4%的患者呈現(xiàn)了肺炎表現(xiàn)，主要為毛玻璃樣陰影（50%）和雙肺斑片狀陰影（46.4%），絕大多數(shù)重癥患者都能以此確診。可見，核酸檢測不能作為確診感染的唯一手段，需要結合患者的臨床癥狀和臨床影像學檢測綜合分析。由此，我們需要進行思考，樣本的新冠病毒核酸檢測為什么陽性率不高呢？這就需要客觀地分析疾病的發(fā)展過程、樣本采集、樣本的保存和運輸、核酸的提取、擴增體系以及人員操作等諸多方面的因素，同時實驗室檢測不能離開臨床癥狀資料的分析。
根據(jù)深圳市第三人民醫(yī)院（南方科技大學第二附屬醫(yī)院）國家感染性疾病臨床醫(yī)學研究中心的人員對來自213 名COVID-19 確診病例的866 份樣本檢測結果進行的分析，結果顯示，發(fā)病后0~7 天采集的痰液、鼻拭子、咽拭子三種類型樣本中，核酸檢測陽性率僅為60%；而且隨著病程發(fā)展三種類型樣本陽性率均有所降低。表明新冠肺炎患者不同的病理時期機體內存在的病毒量不同，不同患者個體病毒存在的主要部位不同，雖然都出現(xiàn)病毒感染，但在相關的部位采集的病毒量較少或根本采集不到病毒，以至于通過實時熒光RT-PCR方法檢測不到。如禽流感的潛伏期從數(shù)小時到數(shù)天，最長可達21天，臨床檢測采集樣本時需采集早期感染的樣本。任何疫病都有一定的潛伏期，不同的個體潛伏期長短不一，潛伏期的長短受多種因素的影響，如病毒的毒力、感染的病毒量、患者的大小和品種、營養(yǎng)狀況、環(huán)境及應激因素等。有的在采樣時感染可能發(fā)生數(shù)天或數(shù)周，不能確定標本采集時是否是樣本采集的最佳時期。此外，在感染早期臨床癥狀不典型，或病毒復制數(shù)量達不到qRT-PCR檢測的閾值，所以這些都不可避免會出現(xiàn)無法檢出的現(xiàn)象。因此，在出現(xiàn)疑似病例，尤其是疫病高發(fā)地區(qū)、流行區(qū)要連續(xù)采集樣本，多次檢測，結合臨床癥狀綜合分析檢測結果。因此臨床上，任何疫病的確診都不能僅靠病原學檢測1次陰性結果就做出疾病排除性診斷。由此我們設想，如果發(fā)病動物經(jīng)初步診斷可能是病毒性感染，須在動物發(fā)病的初期或急性期進行樣品的采集，否則機體的免疫系統(tǒng)會吞噬病毒，導致病毒數(shù)量減少甚至消失，不易檢出，而且臨床上病毒感染的晚期極易繼發(fā)細菌性感染，從而增加檢測判斷的干擾。獸醫(yī)臨床檢測動物活體采樣時，一定要選擇有典型病癥而且未經(jīng)治療的病例，這樣可以獲得動物傳染病的基本信息，同樣這對細菌學的檢測也是至關重要的。對于群體性感染發(fā)病的情況，至少要選擇5個動物進行樣本的采集，每個動物的樣品材料要有足夠的數(shù)量，這樣不僅要保證本次的檢測順利，也要為復檢準備充足的樣品。要想提高核酸陽性檢出率，首先要保證樣本采集部位的準確性。新冠肺炎患者臨床癥狀主要表現(xiàn)發(fā)熱、干咳、乏力，有些伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹瀉等。針對新冠病毒檢測的采集，國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》中指出，鼻咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本中可檢測出新型冠狀病毒核酸，第六版的指南建議采集痰標本，而在第七版提出下呼吸道標本（痰或氣道抽取物）最準確。但臨床病例個體情況差異較大，有的患者無痰，有的下呼吸道的肺泡灌洗液標本采集不便，導致上呼吸道采集的樣本病毒含量低或不含病毒，致使檢測結果差異較大。由此可見，獸醫(yī)臨床上我們要對患病動物的典型部位進行采樣，或者同一患畜多部位采集且合并采集樣本進行檢測。在采樣前對患病動物進行初步診斷，需選擇病原體含量較高的部位進行采集，如呼吸道癥狀明顯的采集鼻咽拭子、口咽拭子，然后放同一采集管中；如有消化道癥狀的同時采集糞便或肛拭子進行混合保存，然后取混合樣進行檢測。對確診為細菌病的動物要注意其血液、尿液、膿汁、分泌物、糞便及腫脹局部組織的滲出液等材料的采集。對于病死畜，需要盡量在無菌條件下采集具有典型病變的器官和組織，以及病原含量較高的臟器或內容物，若需要做病理切片，采集的組織最好在病健結合部。在采集臟器時需注意，一定要保留其被膜或完整的結構，如腎臟要有髄質部等。此外，無論何種疫病病死畜，體內的淋巴結、心、肝、脾、肺、腎有無病變，通常都一并采集。采集人員的操作規(guī)范程度同樣影響樣本的質量及檢出率，比如新冠肺炎疑似病例患者鼻咽拭子采樣時，要求“三個要”，即要深、要轉、要取細胞。“要深”即距離從耳垂到鼻尖長度的一半，“要轉”即轉動10~15s，轉動4~5圈，“要取細胞”即取到鼻咽部的細胞，否則無法保證樣本的質量。假如鼻咽拭子采樣困難，可考慮口咽拭子采樣，此時要注意用拭子擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁3~5次。然后將拭子頭浸入含3ml病毒保存液管中，尾部折斷棄去，立即旋緊管蓋。獸醫(yī)臨床檢測時，除了一些拭子采樣，我們還會有組織、血液、尿液等樣品的采集。無論哪種采集方法和樣品，都要規(guī)范性操作，需盡量保障無菌的條件，特別是用于微生物學的檢查，須采集到含有病毒的細胞和含有細菌的組織等，而且病毒的含量要達到核酸的檢測下限。采集后的患畜部位和采樣用的器械及盛放容器需進行滅菌處理，避免樣品被污染，確保核酸檢測的準確性。在規(guī)范采集方法和保證樣品質量的前提下，還要做好個人的安全防護。因為采集的樣品含有很多的不確定因素，我們盡量按照高一級級別的個人防護，確保個人的人身安全。采樣時如果發(fā)現(xiàn)動物急性死亡，不要隨意剖檢，需進行血涂片的鏡檢，確定不是人畜共患的高致病微生物感染，如炭疽等，之后方可進行解剖采樣。采樣結束后還要對尸體、場地及采樣人員進行嚴格的消毒處理，避免感染性物質的擴散。正確的保存樣品，使病料新鮮或接近新鮮的狀態(tài)，是保證檢測結果準確性的前提條件。臨床采集的樣本會受環(huán)境因素、試劑、保存管等因素的影響，導致細胞破碎釋放出內源性RNA酶，病毒RNA在空氣中也很容易降解，從而影響我們最后的檢出效率。原則上，樣本采集后最好放在防病毒核酸降解的標本采集管中，且及時送到實驗室，盡快完成檢測。標本在室溫下存放時間過長，容易引起核酸的降解，致使檢測結果不能呈現(xiàn)陽性反應。因此，建議樣本采集后室溫存放不超過2~4h，2~8℃條件下不超過72h，如果不能及時檢測需要放在-70℃以下進行保存。同樣，在獸醫(yī)臨床上對于發(fā)病動物的采樣，尤其是采集樣本比較多時，或者是夏季采樣，一定要盡快完成，爭取在4h內完成，對于病死動物需立即采集，否則會出現(xiàn)組織器官的腐敗、變質或變性等現(xiàn)象，這將嚴重影響檢測結果的準確性。針對不同檢測用途的樣品有不同的保存方法，其中血清學檢測，一般采集的血液立即置于無菌試管中密封，室溫放置1h或37℃ 30min，之后進行冷藏保存，需較長時間轉移時要加入適當?shù)目股?；病毒學檢測需要使用含有甘油的保存液低溫保存。樣本轉運時要嚴格遵守國家對感染性物質的運輸要求進行包裝和運送，須在專用的轉移箱中運送，不要與其他物品混雜。防止病料的外漏，根據(jù)檢測目的以最快最直接的途徑送往檢測實驗室。另外，對于轉運及存放標本的容器使用前后及時用 75%酒精進行擦拭或噴灑消毒。對于感染性物質的檢測，如新冠病毒，在處理前先進行病毒滅活，如56~60℃孵育30min，或用試劑盒自帶的采樣液滅活病毒。獸醫(yī)臨床上，很多采集的病料其傳染性也很難估計，因此最好是滅活后再進行檢測，但是，要注意滅活的條件，避免病毒的核酸降解。目前，常用的核酸提取方式有兩種，即手工提取和核酸全自動提取儀提取。手工提取過程復雜，步驟繁多，容易交叉污染，而且操作人員掌握的分子生物學知識和操作技能的熟練程度差異較大，很難做到統(tǒng)一的標準化，而全自動核酸提取儀操作可以避免個人手工操作的差異，易于標準化，但在提取過程中可能產生氣溶膠，進而交叉感染出現(xiàn)“假陽性”現(xiàn)象，同時不同的提取試劑對最后提取到的核酸數(shù)量和質量也可能存在差異。因此，提取的核酸數(shù)量和質量的不同，對將來的核酸擴增至關重要，直接會影響最后的檢測結果。臨床上通過核酸進行病原學的檢測，如果采用手工方法提取，一定要嚴格規(guī)范操作過程，使用全自動核酸提取儀提取，在每次提取后要對提取儀噴灑核酸清除劑，然后用紙擦拭干凈，最后用75%酒精噴灑擦拭（磁棒除外），紫外燈再至少照射半小時，來最大程度的減少核酸提取過程的污染，提高提取核酸的數(shù)量和質量，充分保證檢測的準確性、可靠性。因此，核酸提取的操作人員應經(jīng)過專業(yè)的培訓，具備基本的分子生物學的相關知識和熟練的操作技能，儀器的規(guī)范使用等，避免人員因素和儀器因素對檢測結果準確性的影響。核酸擴增體系一般采用國家標準推薦的反應體系和試劑，為了降低加樣的影響，可適當擴大反應體系，如采用40μl或50μl的反應體系，或通過實驗摸索適合本實驗室檢測的合適的反應體系。另外，每批次擴增建議設置一個弱陽性質控和三個陰性質控，且三個陰性質控的位置要隨機放置在不同的位置，只有弱陽性質控檢測為陽性，三份陰性質控全部檢測為陰性，才視為在控，方可判定樣品的檢測結果，否則則為失控，應及時分析原因，然后重新采樣、重復檢測。在質控在控的條件下，同一份標本中出現(xiàn)不同的檢測結果，也應分析原因，必要時重新檢測樣本。自應用PCR檢測病原以來，出現(xiàn)了諸多的核酸檢測試劑盒。不同廠家的試劑盒根據(jù)病毒基因的特異性序列設計的擴增引物和探針，包含有不同的靶基因位點的試劑檢測靈敏度不同，特異性也不同，試劑中的酶和金屬離子的成分與質量也存在差異，這些最終都將影響核酸的擴增效率和檢測結果。如萬圣等2017年報道對三種禽流感病毒核酸檢測試劑盒比較，陽性檢出率分別為70.0%、45.0%和45.0%。因此，不合適的試劑勢必導致核酸提取失敗，影響核酸檢出率。因此，在進行批量檢測前，一定要進行試劑盒的比對試驗，選擇靈敏度較高的試劑盒。眾所周知，RNA病毒容易在傳播中發(fā)生變異，目前現(xiàn)有的試劑盒主要是針對病毒基因組的保守序列進行引物設計，由于我們對病毒的認知還存有一定的空白，病毒在進化過程中其保守序列是否會發(fā)生突變還不清楚，核酸的檢測試劑也缺乏大規(guī)模的臨床驗證，若病毒RNA的引物設計區(qū)發(fā)生了突變，可直接導致檢測結果不能呈現(xiàn)陽性。
1、提高采樣和檢測人員的理論素養(yǎng)和操作技能對采樣和檢測人員進行系統(tǒng)的培訓，使其在工作前能充分掌握獸醫(yī)專業(yè)基礎知識，對于常見病和多發(fā)病，了解其發(fā)病表現(xiàn)和病原的流行病學規(guī)律，這是準確采集病料的基本條件。同時，還要進行操作技能培訓，尤其是樣本的采集方法，樣品的保存和運輸要求，微生物的分離鑒定，核酸的檢測流程、血清學檢測方法等，正確規(guī)范的操作技能，不僅能有效防止感染性物質的擴散，保證樣品的質量和檢測效果，還能防護個人安全。首選國家相關部門批準的核酸檢測試劑盒，然后實驗室對試劑盒檢測能力驗證分析，挑選靈敏度高、特異性強的試劑盒，作為本實驗室檢測購買的標準。另外，針對不同地區(qū)的發(fā)病情況，再一次篩選，選取適合病原微生物地方分型的檢測試劑，這樣盡可能的保證本實驗室檢測的陽性率和可靠性。另外，要選擇合適的核酸質控品和標準物質，這些在檢測標準化和敏感性評價中發(fā)揮著重要的作用。眾所周知，相比于人類病毒核酸標準物質，動物病毒核酸的標準物質的研究明顯滯后?，F(xiàn)有的商品化病毒核酸檢測試劑盒中，作為質控品的陽性對照多由廠家自行制備提供，缺乏統(tǒng)一的質量控制和量值標定，限制了其監(jiān)控檢測的性能，也難以滿足不同試劑和不同實驗室檢測能力評價的需求。縱觀目前動物病毒核酸質控品研制的特點和優(yōu)缺點分析，以噬菌體為基礎的內嵌病毒樣顆粒與全病毒顆粒最接近，對動物RNA病毒核酸標準物質的研究和應用都有著較為廣闊的前景。3、規(guī)范和優(yōu)化實驗室核酸檢測的流程病毒核酸的檢測是疾病確診的關鍵步驟，采樣和檢測人員要充分做好生物安全防護的同時，必須要按照規(guī)范處理流程才能有效保障檢測結果的準確性、可靠性。首先檢測人員應在安全防護的條件下從運輸箱中取出樣本管，仔細核對采集的樣品信息，標記和錄入相關的信息；然后注意樣本管外部消毒處理，病原的滅活；之后才能進入二級生物安全實驗室進行相應的操作，必須在生物安全柜內打開樣品管，根據(jù)試劑盒要求進行核酸的提取、擴增、數(shù)據(jù)分析、結果審核等操作。樣品檢測完成后要立即進行嚴格的終末消毒程序，如空氣、工作臺、地面、生物安全柜、樣品轉運箱等嚴格徹底地消毒。在條件允許的情況下，實驗室檢測區(qū)進行合理的劃分，盡量確保專屋專用，儀器設備不共用，尤其是核酸檢測分析室。另外，優(yōu)化各項檢測人員的管理，每項檢測需有專門的人員負責，不交叉，不是本項檢測的人員不得進入實驗室該項目檢測區(qū)域。根據(jù)國家相關部門的綜合數(shù)據(jù)分析要求，進一步制定本實驗室的結果解讀規(guī)范，撰寫疫病檢測尤其是核酸檢測、血清學檢測的操作規(guī)范，并組織培訓實施。實驗室制定嚴格的實驗室個人防護和消毒流程。樣本采集時和進入實驗室前，務必采用相應的生物安全防護等級方可進入，如戴防護口罩、帽子、穿一次性隔離衣、防護服、防護靴套、戴護目鏡或面罩、戴雙層手套等。檢測工作結束后，在實驗室相對緩沖間按規(guī)范流程脫掉防護裝備后再出實驗室。工作人員離開實驗室必須洗手和手消毒。相應的防護裝備也應按照相應的消毒清洗流程，如：實驗室空氣消毒，移動式紫外燈消毒1h，走廊進行紫外消毒30min；工作臺面消毒，每天實驗后使用0.5%~1% 有效氯消毒臺面和地面；生物安全柜消毒，每天實驗后用75%酒精對生物安全柜進行擦拭，再開紫外燈消毒30min；轉運容器消毒，轉運及存放標本的容器使用前后及時用 75%酒精進行擦拭或噴灑消毒。近年來，盡管以核酸擴增為基礎的分子檢測技術，以其具有快速、敏感、特異、定量準確，并且對實驗室生物安全環(huán)境要求低等特點，在動物疫病病原的檢測中得到了廣泛的應用，逐漸成為確診動物疫病病原檢測的主要手段，但獸醫(yī)臨床的核酸檢測無法保證結果百分百準確的現(xiàn)象，如同新冠病毒的核酸檢測，不能將其作為臨床診斷的唯一依據(jù)。在實際檢測時一定要結合患畜的臨床癥狀和其他實驗室檢查（血清學檢測等）進行綜合分析、綜合診斷，提高檢測的靈敏度和準確率。
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